製品紹介(取り扱い方法 RBE-12)|ファーマコセル株式会社
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取り扱い方法 [ 解凍からBBBキット™ (RBE-12) の使用まで ]


RBE-12 (PET-12)
RBC-12 (PC-12)
BBBキット
マニュアル・ダウンロード
『RBC-12型』
[ PDF-4.5M B]
『RBE-12型』
[ PDF-4.3M B]
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 1.解凍後のスケジュール
ご使用に当たって、まず解凍していただきます。その後のスケジュールは以下のとおりです。
 
  解凍後、培養液の添加量
  解凍液 培養液1 培養液2
血管側 630 μL 500 μL 500 μL
脳側 1000 μL 1500 μL 1500 μL

※培養液2の組成 10% PDS / DMEM F-12
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/ Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Sigma D-8437
Fetal Bovine Plasma Derived Serum (PDS) 10% (v/v)
Heparin 100 μg/mL
basic fibroblast growth factor (bFGF) 1.5 ng/mL
Insulin-Transferrin-sodium Selenite (ITS) insulin 5 μg/mL,
transferrin 5 μg/mL,
sodium selenite 5 ng/mL
Hydrocortisone 500 nM
Gentamicin 50 μg/mL


 2.BBBキット™ および解凍・培養液の保存方法
BBBキット™ は 、-80℃ で保存してください。(-80℃で 6ヶ月保存できますが、1ヶ月以内にご使用ください。)
解凍液 と培養液は、 -20℃ 以下で保存してください。


 3.BBBキット™ 解凍・培養そしてBBBキット™ の使用まで
  解凍日

1. 付属の 解凍液 をあらかじめウォーターバスやインキュベーターで、37℃ に温めておきます。 解凍液 は、凍ったままウォーターバスやインキュベーターに入れて、温めてください。
2. 37℃に温めておいた 解凍液 をクリーンベンチ内に用意しておきます。
3. ディープフリーザー (-80℃) から BBBキット ™を取り出し、すばやくクリーンベンチの中に入れ、中身を出します。 BBBキット™ を密封しているセロファンの袋は、必ず、クリーンベンチの中で、はずしてください。
(BBBキット™ は構造上とても溶けやすいので、ディープフリーザーから取り出し解凍するまでの工程は、すばやく行ってください。)
4. 取り出した BBBキット ™の表面に、氷や水滴がついている場合は、消毒用エタノールを噴霧し、キムワイプなどでふき取ってください。このとき、プレートを逆さまにしないように注意してください。またプレートの表面についた水滴をキットの中に入れないように注意してください。
5. このあと直ちに、凍った状態のままの BBBキット™ に、解凍液をプレートの脳側に、1000 μL ずつ添加します
(12 well分)。脳側に 解凍液 を添加するときは、インサートのすき間から添加してください。
*脳側(アストロサイト播種部位)は懸濁しないでください。
※5. 〜 7. の工程において、ピペットの先でメンプレンに触れたり、インサートをはずしたり動かしたりしないように注意してください。
アストロサイトが均一に分散されず、BBBキットが正常に機能しない場合があります。
6. 脳側に 12 well分添加したあと、血管側 (インサートの内側) に 解凍液 を 630 μLずつ添加します(12 well 分)。
7. 血管側 (インサートの内側) の細胞を分散させるため、ピペッターで 5 〜 10 回ほど軽く懸濁する(12 well 分)。
解凍作業終了後、プレートの表面と底に残っている水滴を消毒用エタノールで濡らしたキムワイプ等で拭き取ってください。
8. CO2 インキュベーターで、2 〜 3 時間培養します。このとき 培養液1 を 37℃ に温めておいてください。
9. 2 〜 3 時間培養後、倒立顕微鏡で細胞が張り付いていることを確認してください。PBC-12 (PC-12) 型では、ポリカーボネイト製メンブランの特性上、内皮細胞が観察されません。

RBE-12型
内皮細胞(強拡) アストロサイト(強拡)
10. インサートをピンセットで持ち上げ、脳側の 解凍液 を吸引します。インサートを戻し、37℃ に温めていた 培養液1 をインサートのすき間から 1500 μL 脳側に入れます (赤矢印)。次に、血管側 (インサート内) の 解凍液 を吸引し、37℃ に温めていた 培養液1 を 500 μL 加えます。この作業を繰り返し、BBBキット™ すべての well の 解凍液 培養液1 に交換します。
(細胞を傷つけないよう 1 well ごとに吸引して、培養液1 の添加は丁寧に行ってください。)
11. CO2 インキュベーターで、一昼夜培養します。

  解凍翌日

12. 倒立顕微鏡で細胞がコンフルエントになった状態を確認してください。RBC-12 (PC-12) 型は、顕微鏡像が違うことにご注意下さい。(添付の 「RBC-12型」 マニュアル をご参照ください。)

RBE-12型
内皮細胞(弱拡) アストロサイト(弱拡)
13. 付属の 培養液2 を、あらかじめウォーターバスやインキュベーターで、37℃ に温めておきます。( 培養液2 は、凍ったままウォーターバスやインキュベーターに入れて温めてください。)
14. 10. の 解凍液 の吸引と 培養液1 の交換と同じ要領で、培養液1 を吸引し、培養液2 に交換します。
(細胞を傷つけないよう 1 well ごとに丁寧に行ってください。)
15. CO2 インキュベーターで、3 日間培養します。(解凍日から 4 日目まで)
16. 目的の実験を行う。( 4 日目から、BBBキット ™として使用可能です。10 日目まで、TEER 150 Ω x cm2 以上を確認していますが、解凍から6日目いっぱいまでのご使用をお勧めします。

 実験スケジュール(例)


 4.BBBキット™ の経内皮電気抵抗 (TEER)
BBBキット™(RBE-12) は、TEER 150 Ω x cm2 以上を保持しています。
-80℃ で凍結保存していた BBBキット™ を解凍後、培養液1* に交換し、3 日目より TEER を測定しました。
*解凍液、培養液1には cAMP やそのアナログはいっさい含まれておりません。)

※4 日目から、BBBキット™ として使用可能です。10 日目まで、TEER 150 Ω x cm2 以上を確認していますが、解凍から 6 日目いっぱいまでのご使用をお勧めします。
 


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