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【assay buffer：DPBS-H 】
| 10×PBS(+/+) |
100mL |
| d-glucose |
4.5g |
| HEPES (1M) |
10mL |
| DW |
890mL |
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| Total |
1,000mL (検定時37℃) |
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10 x Dulbecco's Phosphate buffered saline (10 x PBS (+/+)
(Sigma: D1283)
d-glucose (和光純薬：041-00595）
HEPES buffer (1M) (Sigma: H0887) |
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■各検体を assay buffer： DPBS-H を用い、1μM になるように調整します。
| 注1） |
測定感度、細胞障害性を考慮して、濃度は変更可能です。 |
| 注2） |
有機溶媒（DMSOなど）で溶かす検体は有機溶媒の最終濃度が 0.5%(V/V)以下になるように調整してください。 |
| 注3） |
検体濃度が 1μMで細胞障害性が出る場合は、低濃度が必要です。
細胞障害性は、検定終了後に経内皮電気抵抗計により測定します。 |
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| 番号 |
サンプル名 |
溶媒 |
濃度 |
濃度 |
保存温度 |
備考 |
| 例 |
PCC-1 |
DMSO |
1 mM |
20 μL |
-20℃ |
- |
| 1 |
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| 2 |
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| 3 |
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| 4 |
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脳内移行性検定は BBBキット™ (RBT-24H) のインサート内側（血管腔側）に化合物を入れ、15分内* に内皮細胞及びペリサイトの層を通過し、プレートのウェル内（脳実質側）に漏れ出てきた化合物濃度を測定します。
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| * 化合物の種類や測定感度によって時間設定を行います。 |
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| 1． |
Assay buffer を 別に用意した 24 well Millipore plate * に 0.9 mL/well ** 入れ 37 ℃で温めておきます。 |
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| 2． |
BBBキット（RBT-24) の血管側から培地を吸い取り、37 ℃で温めた検体を 0.2 mL/ insert ** 入れます。 |
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| 3． |
インサートを、用意しておいた Millipore plate に移し、37 ℃で 15分間 *** インキュベート 。 |
| 4． |
インサートを取り除き、脳側に漏れ出てきた検体を回収する。 |
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| 5． |
回収した検体の濃度を測定し、 Papp 値を算出する。 |
| * |
Millipore Plate (Millipore corporatin #PIMW S24 50) |
| ** |
assay bufferと検体の容量は用いるプレートで異なります。
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| *** |
検定時間について：
検定時間を長くすると、脳側に漏れ出てくる化合物量も多くなり、検出感度が低い化合物の濃度測定がやり易くなりますが、時間と共に BBB キットのバリアー機能（タイトジャンクション機能） も低下し、細胞間隙輸送が亢進します。その結果、正確な判定が出来なくなりますので、 30 分 以内の検定をお勧めいたします。 |
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t=0 |
ｔ=20 |
t=40 |
t=60 |
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血管側
（luminal) |
○
（調整サンプル残り） |
- |
- |
○ |
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脳 側
（abluminal) |
○
（assay buffer） |
○ |
○ |
○ |
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cell + membrane |
− |
- |
- |
○
（必要時） |
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| １．透過係数 (Papp) をもとに化合物の脳内移行性を判定 |
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| ２．解 析 |
濃度測定の結果から透過係数 Papp 値を算出し、既存の薬物・化合物の当社の BBB キット™ で得られた Papp 値がございますので、具体的な Papp 値で定量的に BBB 透過性を評価できます。
薬物・化合物を化学的に装飾するか、種々のベクター等に結合させて BBB 透過性の変化を検定する場合も、Papp の変化として定量的に評価できます。 |
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Papp（×10-6cm/s） |
脳内移行性 |
ex) |
| 脳内移行性 |
>20 |
very good |
受動拡散等で容易に脳内に移行する |
Antipyrine |
| 10〜20 |
good |
一部が脳内に移行する |
- |
| 2〜10 |
low |
ごくわずか脳内に移行する |
Na-F |
| <2 |
very low |
脳内に移行しない |
ESA, sucrose |
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| *Transwell® は Corning, Incorporated, Corning, NY, USA の登録商標です。 |
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| 受託検定価格 |
| 製品番号 |
商品名 |
単位 |
価格（円） |
| PCC-RBT-24H-CT |
受託検定試験 |
プレート |
228,000 |
| ※ |
受託試験ではPCC-RBT-24H を使用しますので、検定時間は15分、透過性は Pappでの判定となります。
（詳しくは、「薬物脳内移行性(BBB透過性)検定」「RBT-24透過性プロトコール」 (PDF-3.8MB) をご参照ください。） |
| ※ |
化合物発送費用はお客様負担とさせていただきます。 |
| ※ |
基本的に 15分後のインサート側（血管側）とプレート側（脳側）の回収サンプルを送り返し、お客様にて濃度測定していただきます。その結果を基に、ファーマコセルから測定結果の報告をさせていただきます。 |
| 例１） 濃度 1ポイントで n＝3、化合物 2＋ポジコン、ネガコン |
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| 例２） 濃度 1ポイントで n＝2、化合物 4＋ポジコン、ネガコン |
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| 例３） 濃度 1ポイントで n＝2、化合物 10＋ポジコン、ネガコン |
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