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取り扱い方法 ［ 解凍からBBBキット™ (MBT-24H) の使用まで ］


MBT-24H
MBT-24F
マニュアル・ダウンロード
『MBT-24型』 [ PDF-MB ]
閲覧には、Adobe Readerが必要です。


　１．解凍後のスケジュール
ご使用に当たって、まず解凍していただきます。その後のスケジュールは以下のとおりです。
 
  解凍後、培養液の添加量
  解凍 １回目の培地交換 ２回目の培地交換
血管側 200 μL 300 μL 300 μL
脳　側 1000 μL 1200 μL 1200 μL

※培養液の組成 10% PDS / DMEM F-12
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/ Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12)  
Fetal Bovine Plasma Derived Serum (PDS) 10% (v/v)
Heparin 100 μg/mL
basic fibroblast growth factor (bFGF) 1.5 ng/mL
Insulin-Transferrin-sodium Selenite (ITS) insulin 5 μg/mL,
transferrin 5 μg/mL,
sodium selenite 5 ng/mL
Hydrocortisone 500 nM
Gentamicin 50 μg/mL


　２．BBBキット™ および解凍・培養液の保存方法
BBBキット™ は 、-80℃ で保存してください。（-80℃で 6ヶ月保存できますが、1ヶ月以内にご使用ください。）
解凍液 と培養液は、 -20℃ 以下で保存してください。


　３．BBBキット™ 解凍・培養そしてBBBキット™ の使用まで
　● 解凍日

1. 付属の培養液をあらかじめウォーターバスやインキュベーターで37℃ に温めておきます。（培養液 は凍ったままウォーターバスやインキュベーターに入れて温めてください。）
2. 37℃に温めておいた培養液をクリーンベンチ内に用意しておきます。
3. ディープフリーザー (-80℃) から BBBキット ™を取り出し、すばやくクリーンベンチの中に入れ、中身を出します。 BBBキット™ を密封しているセロファンの袋は、必ず、クリーンベンチの中で、はずしてください。（BBBキット™ は構造上とても溶けやすいので、ディープフリーザーから取り出し解凍するまでの工程は、すばやく行ってください。）
4. 取り出した BBBキット ™の表面に氷や水滴がついている場合は、消毒用エタノールを噴霧し、キムワイプなどでふき取ってください。このとき、プレートを逆さまにしないように注意してください。またプレートの表面についた水滴をキットの中に入れないように注意してください。
5. このあと直ちに、凍った状態のままの BBBキット™ の脳側に、培養液1000 μL ずつ添加します（12 well分）。脳側に 培養液を添加するときは、インサートのすき間から添加してください。
※5. 〜 7. の工程において、ピペットの先でメンプレンに触れたり、インサートをはずしたり動かしたりしないように注意してください。
アストロサイトが均一に分散されず、BBBキットが正常に機能しない場合があります。
6. 脳側に 12 well分添加したあと、血管側 （インサートの内側） に培養液 を200 μLずつ添加します（12 well 分）。
7. 解凍作業終了後、プレートの表面と底に残っている水滴を消毒用エタノールで濡らしたキムワイプ等で拭き取ってください。
8. CO2 インキュベーターで、2 〜 3 時間培養します。この間に、培養液を 37℃ に温めておいてください。
9. 2 〜 3 時間培養後、倒立顕微鏡でアストロサイトが張り付いていることを確認してください。

アストロサイト 内皮細胞
　MBT-24H は、メンブレンの性質上、内皮細胞を観察することができません（解凍直後は、内皮細胞が観察できます）。
　内皮細胞とアストロサイトの一部のみ鏡検することができますので、その一部を目安に細胞の接着をご確認ください。
10. インサートをピンセットで持ち上げ、脳側の培養液を吸引します。次ぎに、血管側（インサート内）の培養液を吸引し、37℃ に温めていた培養液 を血管側に 300 μL、脳側に 1200 μL 入れます。
この作業を繰り返し、 BBBキット™ すべての well の培地交換を行います。
（細胞を傷つけないよう 1 well ごとに吸引して、培養液  の添加は丁寧に行ってください。）
11. CO2 インキュベーターで、一昼夜培養します。

　● 解凍翌日

12. 倒立顕微鏡でアストロサイトが接着、伸展している状態を確認してください。
アストロサイト
13. 付属の培養液 を、あらかじめウォーターバスやインキュベーターで、37℃ に温めておきます。
14. 10. の培養液 の交換と同じ要領で、培養液を吸引し、温めていた培養液 に交換します。
（細胞を傷つけないよう 1 well ごとに丁寧に行ってください。）
15. CO2 インキュベーターで、3 日間培養します。（解凍日から 4 日目まで）
16. 目的の実験を行ってください。

　実験スケジュール（例）


　４．BBBキット™ （MBT-24H）の経内皮電気抵抗 (TEER)
BBBキット™ （MBT-24H） は、TEER 150 Ω x cm2 以上を保持しています。
-80℃ で凍結保存していた BBBキット™ （MBT-24H） を解凍後、手順通り2回培養液交換し、2 日目より TEER を測定しました。
（培養液には cAMP やそのアナログはいっさい含まれておりません。）

※4 日目から、BBBキット™ として使用可能です。解凍から ６ 日目いっぱいまでのご使用をお勧めします。
 
 
【使用機器】


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