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 1.受託スケジュール


 2.検体の調整
【assay buffer:DPBS-H 】
10×PBS(+/+) 100mL
d-glucose 4.5g
HEPES (1M) 10mL
DW 890mL
Total 1,000mL (検定時37℃)
 
10 x Dulbecco's Phosphate buffered saline (10 x PBS (+/+)
(Sigma: D1283)
d-glucose (和光純薬:041-00595)
HEPES buffer (1M) (Sigma: H0887)
 
■各検体を assay buffer: DPBS-H を用い、1μM になるように調整します。
注1) 測定感度、細胞障害性を考慮して、濃度は変更可能です。
注2) 有機溶媒(DMSOなど)で溶かす検体は有機溶媒の最終濃度が 0.5%(V/V)以下になるように調整してください。
注3) 検体濃度が 1μMで細胞障害性が出る場合は、低濃度が必要です。
細胞障害性は、検定終了後に経内皮電気抵抗計により測定します。
 


 3.受託の際に必要なサンプル情報
番号 サンプル名 溶媒 濃度 濃度 保存温度 備考
PCC-1 DMSO 1 mM 20 μL -20℃ -
1            
2            
3            
4            


 4.薬物脳内移行性(BBB透過性)検定
脳内移行性検定は BBBキット™ (RBT-24H) のインサート内側(血管腔側)に化合物を入れ、15分内* に内皮細胞及びペリサイトの層を通過し、プレートのウェル内(脳実質側)に漏れ出てきた化合物濃度を測定します。
   * 化合物の種類や測定感度によって時間設定を行います。


 5.検定模式図
1. Assay buffer を 別に用意した 24 well Millipore plate * に 0.9 mL/well ** 入れ 37 ℃で温めておきます。
 

2. BBBキット(RBT-24) の血管側から培地を吸い取り、37 ℃で温めた検体を 0.2 mL/ insert ** 入れます。
 

3. インサートを、用意しておいた Millipore plate に移し、37 ℃で 15分間 *** インキュベート 。

4. インサートを取り除き、脳側に漏れ出てきた検体を回収する。
 

5. 回収した検体の濃度を測定し、 Papp 値を算出する。

* Millipore Plate (Millipore corporatin #PIMW S24 50)
** assay bufferと検体の容量は用いるプレートで異なります。
*** 検定時間について:
検定時間を長くすると、脳側に漏れ出てくる化合物量も多くなり、検出感度が低い化合物の濃度測定がやり易くなりますが、時間と共に BBB キットのバリアー機能(タイトジャンクション機能) も低下し、細胞間隙輸送が亢進します。その結果、正確な判定が出来なくなりますので、 30 分 以内の検定をお勧めいたします。


 6.回収サンプル
t=0 t=20 t=40 t=60
血管側
(luminal)

(調整サンプル残り)
- -
脳 側
(abluminal)

(assay buffer)
cell + membrane - -
(必要時)


 7.解 析
1.透過係数 (Papp) をもとに化合物の脳内移行性を判定
 
2.解 析
濃度測定の結果から透過係数 Papp 値を算出し、既存の薬物・化合物の当社の BBB キット™ で得られた Papp 値がございますので、具体的な Papp 値で定量的に BBB 透過性を評価できます。
薬物・化合物を化学的に装飾するか、種々のベクター等に結合させて BBB 透過性の変化を検定する場合も、Papp の変化として定量的に評価できます。

 
Papp(×10-6cm/s) 脳内移行性 ex)
脳内移行性 >20 very good 受動拡散等で容易に脳内に移行する Antipyrine
10〜20 good 一部が脳内に移行する -
2〜10 low ごくわずか脳内に移行する Na-F
<2 very low 脳内に移行しない ESA, sucrose
*Transwell® は Corning, Incorporated, Corning, NY, USA の登録商標です。


 8.価 格

 受託検定価格
製品番号 商品名 単位 キャンペーン価格(円)
PCC-RBT-24H-CT 受託検定試験 プレート 198,000

受託試験ではPCC-RBT-24H を使用しますので、検定時間は15分透過性は Pappでの判定となります。
(詳しくは、「薬物脳内移行性(BBB透過性)検定」「RBT-24透過性プロトコール」PDF(PDF-3.8MB) をご参照ください。)
化合物発送費用はお客様負担とさせていただきます。
基本的に 15分後のインサート側(血管側)とプレート側(脳側)の回収サンプルを送り返し、お客様にて濃度測定していただきます。その結果を基に、ファーマコセルから測定結果の報告をさせていただきます。


 参考例プレートデザイン

例1) 濃度 1ポイントで n=3、化合物 2+ポジコン、ネガコン

例2) 濃度 1ポイントで n=2、化合物 4+ポジコン、ネガコン

例3) 濃度 1ポイントで n=2、化合物 10+ポジコン、ネガコン



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